Clonação e sobre expressão de um gene que codifica para uma proteína de união ao cálcio em Giardia intestinalis
Resumo
As proteínas que unem cálcio do tipo EF-HAND têm um papel muito importante nas vias de transdução de sinais que permitem as células eucariotas
adaptarem-se as mudanças no ambiente externo. O parasita Giardia intestinalis é reconhecido como um excelente modelo para estudar as vias de sinalização, por sua altamente simplificada maquinaria molecular. O objetivo do presente trabalho foi estudar o gene que codifica para uma possível proteína do tipo EF-HAND. O gene foi clonado e a proteína EF 453 foi expressa no parasita. Análises de bioinformática foram realizadas por meio do software I-TASSER. O gene foi
amplificado por PCR com primers desenhados (5ATGACATCTCTGGGTGCCA3 e 5CTAGACCTCAAAAGGCAA3) e foi clonado no vetor de expressão pTubN (possui um tag de HA e um gene de resistência à puromicina) usando E. coli cepa TOP 10. Com o plasmídeo recombinante foi feita a transfecção em trofozoítos de Giardia intestinalis por eletroporação. Logo, foram selecionados os parasitas resistentes à puromicina. Nesses parasitas foi confirmada a expressão da proteína EF-453 por ensaios de Western Blot pela detecção de uma proteina a 55 KDa com um anticorpo contra HA.